基礎研究
mTOR抑制劑對癲癇大鼠免疫微環(huán)境的影響
謝撲松 何金水 周火旺
【摘要】 目的 探討mTOR抑制劑對癲癇大鼠血液和腦組織免疫微環(huán)境的影響。方法 選用40只癲癇大鼠，隨機分為4組，每組10只，空白對照組（生理鹽水干預），不同劑量mTOR抑制劑（雷帕霉素）干預組：低劑量組[1 mg/（kg?d）]，中劑量組[2 mg/（kg?d）] ，高劑量組[4 mg/（kg?d）]。分別進(jìn)行為期8周的干預，8周后處死大鼠，保留大鼠血清及腦組織樣本。經(jīng)ELISA法檢測大鼠血清IL-2、IL-10和IFN-γ水平。經(jīng)流式細胞技術(shù)檢測大鼠腦組織的T細胞亞群。
【關(guān)鍵字】 癲癇,mTOR抑制劑,大鼠,免疫微環(huán)境
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Objective To determine the influence of rapamycin intervention on epileptic rats blood and the brain tissue immune microenvironment. Methods A total of 40 epileptic rats were used in the study and randomly divided into 4 groups (n=10). The blank control group with normal saline intervention, and with different doses of rapamycin: low-dose group [1 mg/（kg?d）], medium-dose group [2 mg/（kg?d）], high-dose group [4 mg/（kg?d）]. Rats in the four groups went through intervention for 8 weeks. After 8 weeks, the rats were sacrificed, rat serum and brain tissue samples were reserved. The ELISA method was used to test peripheral blood (PB), IL-2, IFN-γ and IL-10 levels. Flow cytometry was used to test the state of T-cell subsets.
癲癇是神經(jīng)系統常見(jiàn)疾病之一，癲癇的發(fā)作給患者造成巨大的生理和心理創(chuàng )傷，同時(shí)給患者帶來(lái)沉重的經(jīng)濟負擔。癲癇的發(fā)病機制目前尚未完全明確。有研究表明，癲癇的發(fā)生與膠質(zhì)細胞增生、神經(jīng)元凋亡、免疫炎性反應以及異常通路形成密切相關(guān)[1]。有研究證實(shí)，大腦的炎性反應和免疫損傷在癲癇發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用[2]。許多研究數據顯示激活mTOR信號通路可在遺傳性和獲得性癲癇所起的重要作用[3]。mTOR作為信號級聯(lián)的中央節點(diǎn)影響免疫微環(huán)境中各種信號的輸入，調節各種免疫細胞，包括T細胞、B細胞、NK細胞以及APC等細胞的分化發(fā)育，并影響其功能活性[4]。雷帕霉素是一種mTOR抑制劑，可通過(guò)不同的細胞因子影響信號傳導，從而阻斷T細胞由分化進(jìn)程，發(fā)揮免疫抑制的作用。目前，雷帕霉素干預癲癇模型探討癲癇發(fā)病機制的研究甚少。本研究通過(guò)建立癲癇大鼠模型，用不同劑量雷帕霉素和生理鹽水干預后，觀(guān)察大鼠外周血和腦組織T細胞亞群以及IL-2、IFN-γ和IL-10含量的變化，探討雷帕霉素干預對大鼠血液和腦組織免疫微環(huán)境的影響。
1 材料與方法
1.1材料 將8周齡SPF級雄性大鼠進(jìn)行癲癇建模。研究選用40只建模成功的大鼠，無(wú)水氯化鋰（北京索萊寶科技有限公司），鹽酸毛果云香堿（阿拉?。?，雷帕霉素(中國上海源葉生物科技有限公司)、IL-2、IFN-γ和IL-10試劑盒(R&D SYSTEMS)、RAT CD3、RAT CD4、RAT CD25試劑盒（BD），流式細胞儀、離心機和光學(xué)顯微鏡。本研究經(jīng)廈門(mén)大學(xué)實(shí)驗動(dòng)物管理與倫理委員會(huì )批準（倫理批號XMULAC20220008）。
1.2方法 將40只癲癇大鼠隨機分為4組，每組10只，空白對照組（生理鹽水干預），不同劑量mTOR抑制劑（雷帕霉素）干預組：低劑量組[1 mg/（kg?d）]，中劑量組[2 mg/（kg?d）]，高劑量組[4 mg/（kg?d）]。干預8周后頸脫位處死。取全血5 mL，4 ℃離心10 min，血清保持在-20 ℃。經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測大鼠血清IL-2、IL-10和IFN-γ。取額葉腦組織5 g，用電動(dòng)勻漿器制成組織勻漿，靜置、離心，取上清液保存-80 ℃冰箱備用。分離單個(gè)核細胞經(jīng)RPMI-1640培養基調整，將其置于24孔板內，每孔1 mL。置于孵箱中孵育培養，將細胞懸于100 μL PBS中，加入標記的CD3、CD4和CD25抗體5 μL，室溫避光反應15 min。用PBS洗滌2次，并將細胞懸于300 μL PBS內進(jìn)行流式細胞術(shù)檢測。
1.3 統計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統計分析。對數據進(jìn)行正態(tài)性檢驗，滿(mǎn)足正態(tài)分布，采用單因素ANOVA分析；不滿(mǎn)足正態(tài)分布，采用非參數檢驗；P＜0.05表示差異有統計學(xué)意義。
2 結 果
2.1 ELISA實(shí)驗 每組預計檢測10只，共4組，但在取樣前共有5只大鼠死亡。正常大鼠（未使用生理鹽水或者mTOR抑制劑干預的大鼠）檢測了1只。
2.1.1 IL-2檢測 檢測結果如表1，根據標曲y=0.0008x+0.3329（R2=0.9913）計算得到各組大鼠的IL-2含量。正常大鼠IL-2含量為-27.4 pg/mL。行正態(tài)性檢驗發(fā)現中劑量組不滿(mǎn)足正態(tài)分布，采用非參數檢驗，P＞0.05，IL-2的表達量差異無(wú)統計學(xué)意義。
